pUASTattB Cas9発現ベクター

(プロモーター選択可）

当社のpUASTattBCas9発現ベクターは、条件付きCas9タンパク質発現のトランスジェニックハエを作製するための非常に効果的なシステムです。このベクターシステムは、CRISPR遺伝子編集のためのCas9発現と、バクテリオファージφC31インテグラーゼを介した組換えを組み合わせたものです。また、ユビキタス、組織特異的または誘導性にCas9タンパク質を発現させるために、ユーザー指定のプロモーターを組み込むことができます。

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9システムは、様々な生物において、in vitroおよびin vivoでの遺伝子の不活性化を大幅に促進してきました。このゲノム編集システムでは、Cas9酵素はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム中の18-22ntの相同な標的配列と直接相互作用することで標的特異性をもたらします。gRNAの標的部位へのハイブリダイゼーションによってCas9が特定の位置に誘導され、ゲノム中の標的部位を切断します。Cas9はゲノムをスクリーニングし、gRNAに相補的な配列（プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM) NGGが直後に続く場合）を切断します。二重鎖切断はその後、相同組換えまたは非相同末端結合によって修復され、その結果、様々な長さのインデル（ゲノム中への塩基の挿入または欠失）が生じます。オールインワン・ベクター（Cas9とgRNAの両方を発現する単一ベクター）、またはCas9とgRNAの発現をそれぞれ駆動するためのベクターをそれぞれ導入するだけで、ショウジョウバエでCRISPR/Cas9システムを利用することができ、ノックアウト系統を短時間で作製することができます。

このpUASTattBシステムは、2つの主要なエレメント： (1) φC31インテグラーゼを介する挿入エレメントattBとattP、および (2) GOI (Cas9) の上流にあるユーザー指定のプロモーターから構成されています。attBベクターシステムは、大腸菌プラスミドとして設計された2つのベクターから構成されています。一つはattBベクター（またはφC31ドナーベクター）と呼ばれ、attB部位Cas9遺伝子を搭載しています。もう一つはヘルパープラスミドと呼ばれ、φC31インテグラーゼをコードしています。attBプラスミドとφC31ヘルパープラスミドをattPランディングサイトを含む細胞に共導入すると、φC31インテグラーゼがattB部位とattP部位間の組換えを仲介し、attBベクターは直鎖化され、宿主ゲノムへ挿入されます。また、ドナーベクターをショウジョウバエφC31インテグラーゼ発現株の細胞に注入することもできます。

バクテリオファージφC31は、ファージの付着部位（attPと呼ばれる）と細菌の付着部位（attBと呼ばれる）の間の効率的な配列特異的組換えを仲介するインテグラーゼをコードしています。P-エレメントを介する転移のようなトランスポゾン系とは対照的に、φC31を介する挿入は不可逆的です。attBがattPの位置に挿入されると、ハイブリッド部位（attLおよびattRと呼ばれる）が形成されるが、これらはφC31インテグラーゼによって認識されなくなります。さらに、φC31に基づく挿入は通常はattP部位のみに限定される部位特異的であり、ゲノムの他の部位では起こりません。このため、attBベクターシステムは、ゲノム内にattP "着地点（ランディングサイト） "をゲノム中に持つショウジョウバエ系統で使用するように設計されています。

このCas9発現pUASTattBベクターでは、実験目的に応じて、使用したいプロモーターの配列を入力（貼り付ける）か、当社のショウジョウバエプロモーターデータベースから選択したプロモーターを使用することができます。アクチン5C、ポリユビキチン、α-1チューブリンなどのユビキタスプロモーター、ショウジョウバエの眼球に特異的にGOIを発現させるRh2などの組織特異的プロモーター、Cu+の存在下や熱ショックに応答して発現させるMtnやDmHsp70などの誘導性プロモーターから選択できます。さらに、pUASTattBベクター上のミニホワイト遺伝子は目の色をコードし、導入遺伝子の組換えに成功したトランスジェニックハエを同定するためのマーカーとして使われます。PCRやその他の分子生物学的手法も、トランスジェニック細胞や動物の同定に用いることができます。

ベクターシステムの詳細については、下記の文献をご参照ください。

当社のCas9発現pUASTattBベクターは、φC31インテグラーゼを介したCas9遺伝子の効率的なゲノム挿入を実現するように設計されています。本ベクターは、大腸菌での高コピー数複製とショウジョウバエ系統の高効率遺伝子導入に最適化されています。ユーザー指定プロモーターのベクターでは、Cas9発現を駆動するためのユビキタス、組織特異的、または誘導性プロモーターを選択することができます。

配列特異的な挿入: φC31インテグラーゼはattPサイトで配列特異的な挿入を引き起こしますが、その他のゲノム配列への挿入は起こりません。そのため、内在性遺伝子の破壊や挿入部位の位置によって遺伝子の発現が影響を受けるリスクを減らすことができます。

高効率：φC31インテグラーゼはP因子トランスポゾンを利用したpUASTシステムよりも高効率な生殖細胞への遺伝子導入を実現します。

技術的な煩雑さ: トランスジェニックハエの作製は胚へのインジェクションやハエの飼育・交配など、高い技術が要求されます。

attPサイトが必要：pUASTattBベクターシステムをもちいたトランスジェニックハエの作製には、あらかじめattPサイト（ランディングサイト）がゲノムに導入された特別な宿主株が必要です。

Promoter: 下流の遺伝子の発現させるためのプロモーターが配置される。

Kozak: Kozak配列。真核生物での翻訳開始を促進すると考えられているためORFの開始コドンの前に配置される。

Cas9: Cas9ヌクレアーゼ（CRISPR-associated endonuclease）、gRNAによって局在した個所でDNAを切断する。

SV40 terminator: SV40（Simian virus 40）のポリアデニレーションシグナル。上流ORFの転写停止を助ける。

attB site: バクテリオファージφC31インテグラーゼによって認識されるattBサイト。φC31インテグラーゼは宿主ゲノムにあらかじめ導入されているattPサイト特異的にpUASTattBプラスミドを挿入する。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。

Ampicillin: アンピシリン耐性遺伝子。E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

mini-white: ショウジョウバエのwhite遺伝子の派生型。ミニホワイト遺伝子は成体ショウジョウバエの目の色に関する優性マーカーであり、white遺伝子変異体をバックグラウンドとした遺伝子導入の成否の判断に使用する。